|   摘要   |

     基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)(Structure-based drug discovery, SBDD)是設(shè)計和優(yōu)化創(chuàng)新藥的必要方法。本篇綜述將深入探討冷凍電鏡(cryo-EM)在SBDD領(lǐng)域中的快速崛起及它的主要作用，以及闡釋它如何為高價值藥理學(xué)靶點提供豐富的全新結(jié)構(gòu)信息。冷凍電鏡技術(shù)相比X射線晶體學(xué)的主要優(yōu)勢在于，它可以跳過繁瑣的結(jié)晶步驟，從而直接對玻璃化的生物大分子進行成像；冷凍電鏡也可以提供更多維度的信息，包括異質(zhì)性和動態(tài)性。此外，本綜述還將討論冷凍電鏡近期和未來的發(fā)展，并探討該技術(shù)將在SBDD的管線中產(chǎn)生何種廣泛的影響。

冷凍電鏡時代的SBDD

       SBDD是一種基于靶點的原子級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)信息，針對該靶點進行理性藥物設(shè)計的研發(fā)方法。20世紀80年代，隨著Captopril卡托普利和多佐胺Dorzolamide等酶靶向藥物[1-3]獲批上市，SBDD方法初露鋒芒。這一批由FDA批準的藥物結(jié)合了晶體結(jié)構(gòu)模型與計算機輔助分子建模這兩大新興技術(shù)，并成功解決了傳統(tǒng)濕實驗室的高通量篩選方法(HTS)所面臨的昂貴、耗時及低回報率等問題。此后，隨著計算技術(shù)的不斷革新，大量藥物靶點的晶體結(jié)構(gòu)得以解析，SBDD方法進入了飛速發(fā)展階段。從1999年到2013年，在113個獲批的first-in-class藥物中，有78個是基于SBDD方法發(fā)現(xiàn)的[4]。盡管SBDD的發(fā)展足夠迅速，但學(xué)界及制藥行業(yè)內(nèi)對它的期望顯然更高。SBDD方法往往能另辟蹊徑，對過往認為不可成藥的靶點進行驗證，并進一步開發(fā)新藥。如K-Ras(G12C)靶點，它利用晶體學(xué)結(jié)構(gòu)確定了一個以前未知的結(jié)合口袋，以避免與皮摩爾親和力的GDP/GTP競爭[5]。由于靶點驗證是發(fā)現(xiàn)和開發(fā)工作中的主要難題之一，first-in-class藥物分子可以為靶點的有效性和疾病應(yīng)用提供新的見解，例如bromodomain溴結(jié)構(gòu)域抑制劑(+)-JQ-1和I-BET762，這些化合物被成功用于表征和驗證溴結(jié)構(gòu)域在各種疾病中的重要性，并催生了大量的臨床候選藥物[6]。即使是FDA批準的已知藥物靶點，臨床上也常常需要進一步的SBDD，比如有些藥物需要進行更好的選擇性的優(yōu)化設(shè)計。厄菲替尼(erdafitinib)在經(jīng)過針對性的設(shè)計改造后，表現(xiàn)出了相對于原先藥物對成纖維生長因子受體更高的選擇[7]。此外，有一些藥物可能需要優(yōu)化效力或療效，或提供特定受體亞型的選擇性，如改善鞘氨醇-1-磷酸(S1P)抑制劑西波尼莫德(siponimod)對S1P1而非對S1P3的選擇性，是提高其在療效和安全性上優(yōu)于非選擇性S1P抑制劑的關(guān)鍵[8]。該藥物靶向S1P1，而非S1P3，此外，許多抗病毒、抗菌和抗癌藥物正面臨著抗藥性問題，SBDD方法能夠基于產(chǎn)生耐藥性的靶點結(jié)構(gòu)，對藥物進行持續(xù)改進[9-11]。SBDD工作的瓶頸在于獲取高分辨率的生物靶點結(jié)構(gòu)信息。雖然一些小而有序的生物分子滿足X射線晶體學(xué)的研究范疇，但大部分已知靶點中的蛋白質(zhì)，例如跨膜受體或動態(tài)復(fù)合物，都難以結(jié)晶，導(dǎo)致這些靶點蛋白無法利用晶體手段進行高分辨率結(jié)構(gòu)解析。此外，X射線晶體學(xué)往往會對靶點蛋白進行改造，如進行截短體設(shè)計、引入熱穩(wěn)定性突變或插入一段外源的結(jié)構(gòu)域，從而影響后續(xù)的SBDD結(jié)構(gòu)信息分析。還需要考慮的一個關(guān)鍵因素是，大量的靶點蛋白性質(zhì)上達不到結(jié)晶的條件要求。不過，上述的這些難點正被冷凍電鏡技術(shù)逐一攻克。冷凍電鏡技術(shù)的分辨率已足夠高，其產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)也可用于計算輔助藥物設(shè)計(CADD)方法，這也是本綜述的核心議題。與X射線晶體學(xué)不同的是，冷凍電鏡無需對目標靶點進行結(jié)晶：純化過的靶點生物大分子會被瞬間凍結(jié)在一層薄薄的非結(jié)晶玻璃體冰中，再經(jīng)由透射電鏡成像以記錄下幾十萬到幾百萬個冷凍電鏡顆粒數(shù)據(jù)，用于重構(gòu)三維靜電勢圖并對大分子進行精確建模(見[12]關(guān)于冷凍電鏡的回顧)。因此，這種技術(shù)很適合于蛋白質(zhì)復(fù)合物、熱穩(wěn)定性較低和動態(tài)運動較高的蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)膠束中的跨膜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測定。隨著分辨率的不斷提高，冷凍電鏡已經(jīng)成為藥物設(shè)計的強大工具。

冷凍電鏡與藥物發(fā)現(xiàn)

       在2014年之前，冷凍電鏡幾乎無法解析出優(yōu)于4.0?分辨率的結(jié)構(gòu)，這直接導(dǎo)致它無法對SBDD工作提供有效的數(shù)據(jù)支持。然而，在過去的幾年里，冷凍電鏡方法的爆炸性突破產(chǎn)出了大量高分辨率的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，這在以前是無法實現(xiàn)的。這一質(zhì)的飛躍要歸功于許多技術(shù)革新，如用于記錄圖像的直接電子探測器、改進的計算方法和處理大型數(shù)據(jù)集的硬件集群，這些技術(shù)的飛躍在其他文獻內(nèi)有詳細回顧[13]。此外，作為一種直接可視化的技術(shù)，冷凍電鏡能夠快速判斷樣品的聚集性和穩(wěn)定性等問題，從而通過遺傳和生物化學(xué)手段，用互作因子穩(wěn)定蛋白、或通過優(yōu)化去垢劑從細胞膜環(huán)境中提取膜蛋白等方法來快速改善樣品質(zhì)量。綜合以上，在PDB中的分辨率為4.0?或更高的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的數(shù)量已經(jīng)從2014年之前的合計16個增長到僅2020年一年提交1753個新結(jié)構(gòu)的規(guī)模(圖1, A)。在新上傳的結(jié)構(gòu)中，分辨率高于4.0和3.5 ?的比例分別從2015年的36%和12%增加到2020年的75%和50%。更振奮人心的是，截止2020年，分辨率高于3.0?和2.5?的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)比例，分別達到了18%和3%，實現(xiàn)了冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析前所未來的突破(圖1, B)。為了系統(tǒng)評估冷凍電鏡對SBDD領(lǐng)域的影響，我們(作者)調(diào)查了2018年美國200種最常用處方藥的靶點相關(guān)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)[14]。72%的靶點在PDB數(shù)據(jù)庫中含有結(jié)構(gòu)信息。細分而言，這些結(jié)構(gòu)信息是通過X射線晶體學(xué)技術(shù)(42%)、冷凍電鏡技術(shù)(15%)或兩者結(jié)合(15%)而確定的(圖1, C)。通過冷凍電鏡技術(shù)解析的靶點涵蓋了許多跨膜蛋白，如離子通道(GABAA、CaV、NaV和KATP)、激活態(tài)的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)和轉(zhuǎn)運體蛋白(5-羥色胺轉(zhuǎn)運體、NaCl轉(zhuǎn)運體)。

圖1.冷凍電鏡分辨率的提高及其對蛋白質(zhì)藥物結(jié)構(gòu)表征的貢獻。(A) PDB中上傳的低于特定分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的絕對數(shù)量；(B) PDB中上傳的低于特定分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)的百分比的[61]。(C)2018年200個熱門處方藥的靶點圖，按靶點的結(jié)構(gòu)特征分類；(D)44個熱門GPCRs處方藥的靶點圖，按結(jié)構(gòu)特征分類；(E)2018年200個銷量最高的藥物的靶點圖(作為新藥的代表)，按靶點的結(jié)構(gòu)特征分類。2020年的數(shù)據(jù)是由Njardarson實驗室公示的2018年200種最受歡迎的處方藥和200種銷量最高的藥物的蛋白質(zhì)靶點(如果適用)，然后在PDB中確定相關(guān)結(jié)構(gòu)，進行人工篩選。


     在200多種最常見的處方藥中，GPCRs占據(jù)了44種，這些藥物包括靶向GPCRs的激動劑、拮抗劑和反向激動劑(圖1, D；注意，拮抗劑和反激動劑在藥理學(xué)上不同，但在這里我們(作者)把它們統(tǒng)一歸為拮抗劑)。這些GPCRs中的32個(73%)已經(jīng)進行了某種形式的結(jié)構(gòu)解析，包括與拮抗劑(44%)或激動劑(7%)結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，與激動劑(9%)結(jié)合的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，或由X射線晶體學(xué)和冷凍電鏡手段共同進行的結(jié)構(gòu)解析(20%)。值得注意的是，GPCR的高度動態(tài)結(jié)構(gòu)使其難以獲得高質(zhì)量的晶體，因此大多數(shù)的GPCR晶體結(jié)構(gòu)都是與拮抗劑結(jié)合后才得以進行結(jié)構(gòu)解析的。綜上所述，冷凍電鏡技術(shù)在針對市場上已經(jīng)存在多年的處方藥中中具有深刻影響。為了更加深入了解冷凍電鏡技術(shù)在未來藥物發(fā)現(xiàn)中的作用，我們(作者)還調(diào)查了2018年取得最高利潤的200種藥物，以代表那些市面上新進發(fā)現(xiàn)的藥物[14](圖1, E)，我們簡稱新藥。這批新藥和之前提到的那些最常用的藥物之間存在明顯的差異。相當一部分新藥已經(jīng)用晶體學(xué)進行了表征，反映了結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)在當今藥物研發(fā)工作中的重要性：即便不是由結(jié)構(gòu)驅(qū)動的，也很少有不追求結(jié)構(gòu)的情況，因為結(jié)構(gòu)信息可以為先導(dǎo)化合物的優(yōu)化和進一步發(fā)現(xiàn)提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。此外，考慮到漫長的藥物開發(fā)時間，冷凍電鏡這一最近幾年才崛起的新技術(shù)在這份名單中的占比雖小，但貢獻仍相當可觀。這些藥物和靶點包括生物制藥、離子通道和GPCRs，以及其他不適合結(jié)晶的高活性大分子。

冷凍電鏡對SBDD的貢獻解析新型結(jié)構(gòu)

       雖然有許多FDA批準的藥物靶點結(jié)構(gòu)可被X射線晶體學(xué)解析，冷凍電鏡正在為越來越多的難結(jié)晶、甚至不可結(jié)晶的靶點打開大門，如分子量更大、更動態(tài)的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復(fù)合物。冷凍電鏡也顯著降低了對細胞內(nèi)復(fù)合體的研究難度，如病原體的核糖體、染色質(zhì)修飾復(fù)合體和轉(zhuǎn)錄機器[15-17]。例如冷凍電鏡技術(shù)近期解析了一種與線粒體體RNA聚合酶復(fù)合體相關(guān)的first-in-class 抑制劑的結(jié)構(gòu)[18]。值得注意的是，在膜蛋白領(lǐng)域，冷凍電鏡的貢獻無可比擬。不管是傳統(tǒng)的藥物，還是新型處方藥，很多藥物靶向針對GPCRs、離子通道和轉(zhuǎn)運體蛋白。然而，利用X射線晶體學(xué)手段來解析膜蛋白的結(jié)構(gòu)非常困難。盡管脂質(zhì)立方結(jié)晶在GPCR領(lǐng)域取得了一些進展，但在結(jié)晶過程中，GPCR蛋白通常需要進行熱穩(wěn)定突變，或融合其他蛋白進行改造，以促進晶體的形成。并且，為了獲取某種改造后的穩(wěn)定的構(gòu)象，還需要對克隆構(gòu)建、實驗方法及條件進行大量繁瑣復(fù)雜的篩選[19, 20]。相比之下，冷凍電鏡結(jié)構(gòu)可以直接用來解析經(jīng)過去污劑或納米盤處理后的在生化上性質(zhì)穩(wěn)定的膜蛋白，并獲得處于或者接近生理狀態(tài)的蛋白的結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡的在解析龐雜的膜蛋白的結(jié)構(gòu)中能力勢不可擋，并且已有大量的高分辨率結(jié)構(gòu)被成功解析。長久以來膜蛋白一直都是獲批藥物的熱門靶點，它們的結(jié)構(gòu)也只是近期才被冷凍電鏡揭示(圖2)。

圖2. G蛋白偶聯(lián)受體、轉(zhuǎn)運體(上排)和離子通道(下排)，每個受體有相應(yīng)的FDA批準的配體分子(藍框)。

        

利用冷凍電鏡解析膜蛋白結(jié)構(gòu)的突出進展，部分原因受益于新試劑的設(shè)計和使用。這些試劑可以在體外純化過程中維持跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)，在冷凍制樣過程中保護蛋白，并為高分辨率的結(jié)構(gòu)解析提供均質(zhì)樣品。去垢劑如正十二烷基β-D-麥芽糖苷(DDM)和月桂基麥芽糖新戊二醇(LMNG)，可以有效地從細胞膜上溶解跨膜蛋白，并維持蛋白質(zhì)的生理狀態(tài)構(gòu)象。去垢劑的使用也會產(chǎn)生一些問題，如去垢劑形成的空膠束和與包裹蛋白質(zhì)的去垢劑同時存在存在會引起樣品的不均一，對后期的數(shù)據(jù)處理處理產(chǎn)生影響；也可能會導(dǎo)致冷凍樣品制備時的氣液界面收到破壞，產(chǎn)生一些不好的結(jié)果[21]。脂質(zhì)納米盤是去垢劑的一種替代品，原則上可以為結(jié)構(gòu)和生物物理研究提供接近勝利狀態(tài)的脂質(zhì)雙分子層。脂質(zhì)納米盤在膜蛋白藥物靶點上的應(yīng)用已經(jīng)非常關(guān)鍵和廣泛。舉例而言，將納米盤與冷凍電鏡技術(shù)相結(jié)合，成功闡明了TRPV1和TRPV5離子通道(在TRPV1的情況下，脂質(zhì)對抑制劑的結(jié)合至關(guān)重要)、GABAA配體門控離子通道、人類P-糖蛋白以及GPCR-β-arrestin復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)和機制[22-26]。關(guān)于納米盤的進一步介紹可查閱[27, 28]。冷凍電鏡還可以用來解析嵌入脂質(zhì)體中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，允許在更接近生理狀態(tài)的的電化學(xué)梯度中對離子通道以及孔蛋白進行可視化研究[29, 30]。在過去的幾年中，冷凍電鏡也在生物制藥領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大影響。在較新的藥物中，生物制藥的占比正越來越高。如果僅將目光聚焦于藥物靶點識別這一領(lǐng)域，生物制藥的結(jié)晶技術(shù)確實稱得上有所改善。然而，冷凍電鏡已經(jīng)為一些關(guān)鍵的生藥物研發(fā)提供了基于全長蛋白的結(jié)構(gòu)信細節(jié)息胰島素受體一種二聚化的酪氨酸激酶受體蛋白，在調(diào)節(jié)人體的葡萄糖平衡方面起著關(guān)鍵作用。胰島素受體信號通路的失調(diào)會引起一些疾病，如II型糖尿病，全球約有9.3%(4.63億人)受到影響[31]兩個獨立的研究小組利用冷凍電鏡在胰島素受體結(jié)構(gòu)解析方面取得了突破進展；第一個小組以4.3?和7.2?的分辨率分別解析了與一個或兩個胰島素分子結(jié)合的胰島素受體胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，第二個小組以3.1?的分辨率獲得了與四個胰島素分子結(jié)合的胰島素受體胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(圖3, A)。這些結(jié)構(gòu)解釋了胰島素受體結(jié)合胰島素的不同結(jié)合位點，以及激活這一關(guān)鍵藥物靶點所進行的構(gòu)象變化[32, 33]。


 
     類似的例子比比皆是：從HER2-trastuzamab-pertuzumab復(fù)合物到SARS-CoV-2和中和抗體的結(jié)構(gòu)解析，冷凍電鏡為生物治療的新老靶點提供了新的視點，為進一步發(fā)現(xiàn)和開發(fā)仿制藥和first-in-class藥物鋪平了道路。另一個值得注意的例子是B淋巴細胞抗原CD20，它是治療白血病和自身免疫性疾病的一個重要的治療靶點，盡管其功能作用仍不清楚。盡管CD20的分子量較小，只要35kDa左右，但分別與單克隆抗體利妥昔單抗(rituximab)、奧法圖單抗(ofatumumab)和奧比努單抗(obinutuzumab)的Fab結(jié)合形成復(fù)合物后，都解析獲得分辨率較高的CD20復(fù)合物結(jié)構(gòu)(圖3, B)[36, 37]。負染結(jié)果顯示，利妥昔單抗與CD20結(jié)合后，可誘導(dǎo)形成高度有序的高級結(jié)構(gòu)[36]，這一發(fā)現(xiàn)對激活先天免疫的補體系統(tǒng)提供了全新見解。由于復(fù)合物中的高度動態(tài)和跨膜結(jié)構(gòu)域的存在，利用結(jié)晶手段結(jié)構(gòu)解析幾乎不可能實現(xiàn)，冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用實現(xiàn)了這一可能。



圖3.冷凍電鏡(cryo-EM)在小分子和生物制藥發(fā)現(xiàn)方面的效用。(A)與胰島素結(jié)合的胰島素受體(PDB ID 6PXV)和(B)CD20與利妥昔單抗復(fù)合物(PDB ID 6VJA)冷凍電鏡密度圖。(C)使用GemSpot(PDB ID 6CVM)將小分子PETG精確地建模到β-半乳糖苷酶的冷凍電鏡圖像中。(D)基于片段的PKM2的發(fā)現(xiàn)，冷凍電鏡密度允許正確識別和放置發(fā)現(xiàn)片段(PDB ID：6TTF)

      盡管冷凍電鏡在膜蛋白結(jié)構(gòu)測定領(lǐng)域已經(jīng)邁出了一大步，但短板仍然存在。其中一個短板是解析小于50-70kDa的沒有明顯的胞內(nèi)或胞外結(jié)構(gòu)域的單體膜蛋白，由于幾乎沒有胞外結(jié)構(gòu)域特征，因此難以對去垢劑膠束或脂質(zhì)納米盤進行降噪處理，以這種方式收集到的數(shù)據(jù)難以產(chǎn)出高分辨率結(jié)構(gòu)，比如解析沒有上下游偶聯(lián)蛋白的處于非活性狀態(tài)的的GPCR結(jié)構(gòu)。然而，大量的蛋白質(zhì)屬于這一類型，解析這一類型的的膜蛋白因此也成為了一個重要的研究領(lǐng)域。目前，有一些解決方案正處于研究階段，且已經(jīng)取得了一定程度的成功，如前文所述的CD20。隨著利用增加融合蛋白、抗體片段、納米抗體、納米抗體衍生物或其他支架蛋白以增加靶點蛋白的分子量等方法的應(yīng)用，預(yù)計冷凍電鏡在膜蛋白結(jié)構(gòu)測定方面會有更多進展。

計算賦能冷凍電鏡

       冷凍電鏡單顆粒技術(shù)利用數(shù)百萬個顆粒的可視化投影來重建靜電勢圖，這通常涉及數(shù)十萬億字節(jié)的原始數(shù)據(jù)。因此，該方法從計算方法的快速發(fā)展中獲益匪淺，這些計算方法同時滿足了對更高的分辨率的需求并加深了對粒子動力學(xué)的理解。然而，與X射線晶體學(xué)相比，冷凍電鏡在獲取配體-靶點復(fù)合物的高可信度模型時仍然面臨著一些難題。其中一個難題是冷凍電鏡難以解析得到高于2.5?的蛋白結(jié)構(gòu)，而這通常是建模人員能夠精確放置配體并解析出結(jié)合位點處水分子的最低分辨率。此外，冷凍電鏡的結(jié)構(gòu)建模流程與晶體學(xué)完全不同：在晶體學(xué)中，模型和密度圖之間有一套嚴格而完善的統(tǒng)計測量方法，該方法能夠提供和模型精度相關(guān)的關(guān)鍵信息。而在冷凍電鏡方法中，基于密度圖的建模是一個完全獨立的過程，僅適用收集的電鏡投影來進行密度圖重構(gòu)，然后基于密度圖進行結(jié)構(gòu)建模和實空間下的微調(diào)。該過程的獨立性使得模型的精度被降低了。這一問題在最近已得到改善[38]。此外，兩種方法之間還存在一些物理上的差異，如晶體學(xué)依賴電子密度圖，而冷凍電鏡依賴靜電勢圖。這些差異加在一起，使得晶體學(xué)的模型驗證工具無法應(yīng)用于冷凍電鏡模型。因此，我們可能需要為精確性開發(fā)一些新的指標。一種解決方案是使用強大的計算技術(shù)和精確的分子力場對大分子及其配體在冷凍電鏡結(jié)構(gòu)中的相互作用進行模擬。比如PHENIX軟件包結(jié)合實空間和傅里葉空間微調(diào)和OPLS3e力場的分子動力學(xué)模型，從而生成生物分子和小分子的幾何統(tǒng)計精修模型[39]。OPLS3e微調(diào)工具已經(jīng)被整合進到我們(作者)的自研軟件GemSpot，它將各種計算方法整合為一個工作流程，從而提高冷凍電鏡密度圖中配體位置的準確性(圖3C)[40]。新的計算工具也推動冷凍電鏡在基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)(Fragment-based drug discovery)中發(fā)揮作用，其中高溶解度的小片段化合物被浸泡在由多個不同結(jié)構(gòu)的化合物組成的生物分子靶點中。解析復(fù)合體的結(jié)構(gòu)可以解釋配體與結(jié)合口袋之間關(guān)鍵位點的相互作用，然后可以將其組合成一個先導(dǎo)化合物。然而，這種方法要求配體密度質(zhì)量高、分辨率高，才能正確區(qū)分配體的姿態(tài)和原子類型，目前對于冷凍電鏡來說還是一個難題。最近，Saur等人在高度棘手的β-半乳糖苷酶和頗具治療意義和挑戰(zhàn)性的激酶PKM2的場景中成功地將冷凍電鏡用于FBDD[41]。盡管他們?yōu)榱藢⑴潴w置放于密度圖中，而不得不將干法和濕法實驗結(jié)合，但他們成功地建立了一個與β-半乳糖苷酶結(jié)合的大約150kDa的精準片段模型。更令人印象深刻的是，他們能夠從四種化合物的雞尾酒中確定哪些片段與PKM2結(jié)合(圖3, D)。因此，不斷發(fā)展的計算方法為冷凍電鏡密度圖的構(gòu)建提供了一個強大的平臺，可以在高分辨率下對大分子復(fù)合物進行建模。

冷凍電鏡的快速發(fā)展可及性與通量的提升

       冷凍電鏡是極為精密且昂貴的儀器，需要大量的費用和人力成本來搭建、維護與操作。這一特性在很大程度上限制了冷凍電鏡的發(fā)展，并將冷凍電鏡的機時資源集中在了那些受政府資金扶持的大型機構(gòu)上。因此，在科研界中，冷凍電鏡資源的獲取門檻極高。然而，這一門檻正在被逐漸降低：許多國家級設(shè)施都啟動了冷凍電鏡人才培養(yǎng)計劃，以降低冷凍電鏡運維的人力成本。一些大型制藥公司也開始進行內(nèi)部投資，設(shè)立最先進的冷凍電鏡設(shè)施。此外，冷凍電鏡設(shè)施的可復(fù)制性遠超晶體學(xué)極其昂貴的同步加速器和線性加速器，使得該技術(shù)更有發(fā)展前景。隨著100kV電子束技術(shù)的發(fā)展[42]，未來可能會出現(xiàn)性價比極高的冷凍電鏡，增加其在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域中的應(yīng)用場景。鑒于2018年FDA批準的藥物中有49%來源于中小型公司，降低冷凍電鏡的成本將使冷凍電鏡技術(shù)得到更廣泛的應(yīng)用。最近對SARS-CoV-2相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)表征證明了冷凍電鏡的無限潛力。在病毒爆發(fā)后的幾個月內(nèi)，科學(xué)家們利用冷凍電鏡，以極快的速度解析了新冠病毒刺突蛋白的幾種構(gòu)象，以及它與人源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶或許多中和人源抗體片段的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)[35, 43-46]。最近獲得FDA批準的用于治療COVID-19的再利用藥物瑞德西韋(Remdesivir)與SARS-CoV-2 RNA聚合酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)也已被冷凍電鏡解析[47]。鑒于X射線晶體學(xué)一直是病毒RNA聚合酶結(jié)構(gòu)測定的傳統(tǒng)方法，對新冠病毒的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析是一個顛覆性的創(chuàng)新，凸顯了冷凍電鏡的高時效性特點在快速反應(yīng)研究中的應(yīng)用。此外，冷凍電鏡的分辨率仍在大幅提高，最近的一份報告指出，作為冷凍電鏡的代表性復(fù)合物結(jié)構(gòu)，去鐵蛋白apoferritin的分辨率達到了1.25?，該分辨率足以對單個原子進行精準定位，在某些情況下甚至可以解析氫原子和質(zhì)子化態(tài)[48, 49]。毋庸置疑，在樣品制備良好的情況下，冷凍電鏡的不斷改進將持續(xù)打破結(jié)構(gòu)解析的分辨率記錄。冷凍電鏡在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)方面的應(yīng)用將進一步受益于該技術(shù)的全面自動化。在載網(wǎng)準備方面，一些自動化工具正在出現(xiàn)，以解決不可重復(fù)性和樣品浪費的難題[50-52]。這些技術(shù)的改進不僅會提高自動化的程度和可及性，還可能解決冷凍電鏡載網(wǎng)制備中的其他難題，如減少顆粒在空氣及水中的暴露程度[53]。此外，機器學(xué)習(xí)方法和深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)也是提高顆粒篩選速度和準確性的關(guān)鍵[54, 55]。這些自動化方法甚至有望在未來成為冷凍電鏡的核心技術(shù)，從而推動冷凍電鏡在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的發(fā)展。主流硬件和軟件的改進也有望提高冷凍電鏡在SBDD領(lǐng)域的可及性。例如，更高效的檢測設(shè)備能顯著提高冷凍電鏡的產(chǎn)能。在一個標準的數(shù)據(jù)收集過程中，老式的檢測器相機可以每次收集1個影像，每小時產(chǎn)生50個影像，而較新的檢測器可以每次收集9-16個影像，每小時可以產(chǎn)生超過200個影像，進而轉(zhuǎn)化為每24小時收集的數(shù)百萬顆粒投影數(shù)據(jù)。此外，雖然今天許多最高分辨率的結(jié)構(gòu)是用300kV冷凍電鏡獲得的，但這些機器非常龐大，且前期和維護成本昂貴。在許多情況下，對于單顆粒分析中使用的薄樣品，200kV的顯微鏡可能就足夠了，甚至100kV的顯微鏡也可以用來獲得分辨率高達3.4 ?的結(jié)構(gòu)[42]。

分子動力學(xué)的新窗口

      結(jié)合硬件和數(shù)據(jù)處理方面的改進，冷凍電鏡的潛力將進一步被釋放。當X射線晶體學(xué)受限于結(jié)晶條件而無法解析時，冷凍電鏡的低樣品需求大幅降低了數(shù)據(jù)收集的門檻，使我們得以看到樣品的構(gòu)象連續(xù)體或一系列不同的能量最低狀態(tài)，為大分子動力學(xué)提供了新的窗口。




圖4.單一的冷凍電鏡數(shù)據(jù)集，投影的三維分類顯示了兩種不同的構(gòu)象，代表了兩種不同的G蛋白偶聯(lián)受體-G蛋白相互作用的狀態(tài)，代表了兩種熱力學(xué)上可比較的構(gòu)象。在典型狀態(tài)下(左邊，PDB ID 6OS9)，受體以典型的方式與G蛋白結(jié)合，其中核苷酸結(jié)合口袋為GTP結(jié)合做準備。在非經(jīng)典狀態(tài)下(右圖，PDB ID 6OSA)，G蛋白異源三聚體與經(jīng)典狀態(tài)相比旋轉(zhuǎn)了45°，代表了沿G蛋白偶聯(lián)途徑的中間配體結(jié)合受體狀態(tài)。縮寫：α-N=G蛋白的N端α螺旋；cryo-EM=冷凍電鏡；TM=跨膜螺旋。


一些計算工具，例如二維和三維分類以及子區(qū)域的重點細化，能夠利用數(shù)據(jù)集內(nèi)顆粒的異質(zhì)性來模擬大分子活性成分的運動。在我們(作者)小組最近的一個例子中，對神經(jīng)緊張素1受體的冷凍電鏡單顆粒分析結(jié)果揭示了先前識別的G蛋白、激動劑結(jié)合狀態(tài)和G蛋白偶聯(lián)通路上的一個新的中間狀態(tài)(圖4)[57]。最近，我們(作者)還將AI深度學(xué)習(xí)網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用于冷凍電鏡數(shù)據(jù)集，揭示了26S蛋白酶體的構(gòu)象動態(tài)，使解析出的結(jié)構(gòu)細節(jié)達到了前所未有的原子級水平[58]。隨著分辨率和分類工具的不斷改進，我們將獲得更精細的構(gòu)象變化。有了以上這些技術(shù)，再加上分子動力學(xué)模擬和機器學(xué)習(xí)方法等計算技術(shù)，我們將得以對配體結(jié)合的復(fù)雜過程進行更精確的建模，從而揭示全新的、可成藥的中間狀態(tài)。

結(jié)語

      盡管冷凍電鏡已經(jīng)在SBDD領(lǐng)域取得了飛躍性的進展，但它的潛力遠不止于此。在三維分析重構(gòu)及深度學(xué)習(xí)算法等領(lǐng)域，若能將計算工具與更大、更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集結(jié)合并進行訓(xùn)練，我們將能夠描述蛋白質(zhì)甚至其配體的更小幅度、更高分辨率的動態(tài)運動。我們還期望冷凍電鏡在時間維度上的結(jié)構(gòu)解析方法將使人們對大分子復(fù)合物的結(jié)合和解離過程有更深了解，為靶向藥物的研發(fā)提供更多思路和機會[59,60]。目前晶體學(xué)和大多數(shù)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)所提供的只是能量最小值的瞬間結(jié)構(gòu)，但對于開發(fā)新的藥物作用模式而言，對機制和中間狀態(tài)的理解至關(guān)重要，所以我們?nèi)裟塬@取構(gòu)象的動態(tài)信息，則對理性藥物設(shè)計具有突破性意義。在綜合了冷凍電鏡的軟硬件及方法的快速發(fā)展之后，我們可以得出結(jié)論：冷凍電鏡有望為藥物發(fā)現(xiàn)和人類健康做出巨大貢獻。

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關(guān)于晶蛋生物

深圳晶蛋生物醫(yī)藥科技有限公司成立于2019年8月，致力于慢性腎病、抑郁癥和惡性腫瘤等重大疾病的膜蛋白創(chuàng)新藥物研發(fā)，立志成為全球極具創(chuàng)新力和影響力的企業(yè)，近日已完成近億元Pre-A輪融資。

核心團隊由哈佛大學(xué)、中科院上海藥物所等多所頂尖科研院所和制藥公司的博士組成，在膜蛋白抗原抗體、藥物靶點結(jié)構(gòu)解析、基于結(jié)構(gòu)和人工智能的藥物研發(fā)和藥理學(xué)等領(lǐng)域的研發(fā)能力處于國際一流水平。

公司于2020年獲得中國深圳創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽生物醫(yī)藥行業(yè)一等獎、2020年“科創(chuàng)中國”先導(dǎo)技術(shù)獎、第九屆中國創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽全國優(yōu)秀獎、科創(chuàng)中國科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽TOP10和粵港澳大灣區(qū)生物科技創(chuàng)新企業(yè)50強等獎項。

詞表：

1. 激動劑

一種通過增加受體活性以產(chǎn)生生物反應(yīng)的物質(zhì)。

2. 拮抗劑(也稱中性拮抗劑)

一種能阻斷激動劑或反向激動劑的物質(zhì)，在不存在激動劑或反向激動劑的情況下便沒有活性

3. 生物制藥

在生物活體中制造的藥物，可能含有重組蛋白、糖類、基因療法或核酸。

4. 電子密度圖

電子密度與晶體中每一個晶胞位置的關(guān)系圖，以二維或三維表示，由解析X射線衍射圖案得出。

5. 靜電勢圖(即庫侖勢圖)

即樣品中電荷分布的二維或三維表示。在電子顯微鏡中，靜電勢圖由電子被與樣品相互作用時產(chǎn)生的庫侖力散射而產(chǎn)生。

6. 基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)FBDD

一種藥物篩選方法，以評估小分子量的化學(xué)片段與期望靶點相結(jié)合的能力的方式，確認后續(xù)的藥物化學(xué)實驗方向。

7. 反向激動劑

一種通過減少受體的基礎(chǔ)活性以產(chǎn)生生物反應(yīng)的物質(zhì)。

8. 脂質(zhì)立方相結(jié)晶

基于脂立方相的蛋白結(jié)晶技術(shù)，采用脂立方相模擬生物膜環(huán)境，膜蛋白可以在脂質(zhì)雙分子層中相互接觸，在合適的條件下形成晶體。

9. 脂質(zhì)納米盤

一個紐扣電池形狀的盤狀脂質(zhì)雙層，由兩個環(huán)繞的兩親性螺旋蛋白(膜支架蛋白)穩(wěn)定并使其可溶于水。

10. 冷凍電鏡負染

一種將重金屬鹽染色劑嵌入并固定在生物標本上，并在室溫下進行電子顯微鏡成像的技術(shù)方法。盡管只能在低分辨率(~2納米)下觀察標本的形狀，但這種技術(shù)對于簡單和快速評估樣品質(zhì)量是很有價值的。

11. 時間分辨的冷凍電鏡方法

在動態(tài)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的特定時間間隔內(nèi)對生物樣本進行速凍，并使用冷凍電鏡技術(shù)進行可視化的方法。

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